La neurotrasmissione glutammatergica 4/ Ruolo dello ione zinco

Eccoci giunti alla quarta parte! In questo articolo andiamo alla scoperta della connessione tra l’omeostasi sinaptica dello zinco e l’eccitotossicità da glutammato, per poi trattare il ruolo dello zinco nella modulazione della neurotrasmissione glutammatergica. Lo zinco, nella forma ionica (Zn²⁺), è un elemento importante nella biologia di microrganismi, piante e animali, incluso l’uomo. E’ il secondo elemento di transizione più abbondante negli orgamismi viventi, dopo il ferro, ed è l’unico metallo che si ritrova in tutte le classi enzimatiche. Si stima infatti che circa il 10% delle proteine umane –  ossia intorno a 2800 proteine – contiene zinco, nella sua struttura. Nel corpo umano sono distribuiti tra 2 e 4 grammi di zinco. La maggior parte si trova nel cervello, nei muscoli, nelle ossa, nei reni, nel fegato, con le più alte concentrazioni nella prostata e negli occhi.

Dal punto di vista biochimico, lo ione zinco (Zn²⁺) si comporta da catalizzatore acido di Lewis oppure svolge semplicemente un ruolo strutturale. Non interviene mai nei processi di ossido-riduzione, dato che il suo unico stato di ossidazione è +2. Tanto per fare qualche esempio, nel sangue, lo zinco è prevalentemente legato a bassa affinità con l’albumina, ma si può trovare anche legato alla transferrina (principale trasportatore di ferro nel sangue). Negli enterociti e negli epatociti, in particolare nell’apparato del Golgi di queste cellule, lo zinco viene immagazzinato dentro le metallotioneine, una famiglia di proteine ad alta affinità per i metalli pesanti caratterizzate da un ricco contenuto in cisteina.

Nelle proteine, lo zinco ha alta affinità di legame con gli aminoacidi istidina (His), glutammato (Glu) e cisteina (Cys), con cui forma composti di coordinazione a geometria tetraedrica. Un esempio è il dominio chiamato “zinc finger“, piccolo e irregolare, dove uno ione zinco è coordinato a due residui di cisteina e a due di istidina.

Nella struttura dell’anidrasi carbonica umana di tipo II, enzima che nei globuli rossi catalizza sia la reazione diretta tra anidride carbonica e acqua a dare idrogenocarbonato e protone sia quella inversa, che da idrogenocarbonato e protone ripristina anidride carbonica e acqua, lo ione zinco costituisce il sito attivo e si trova immerso in una cavità, coordinato in modo tetraedrico a tre gruppi imidazolici di residui di istidina (His-94, His-96 e His-119) e ad una molecola di acqua.

La molecola d’acqua è resa particolarmente acida dall’interazione con lo ione zinco e si ionizza per catalisi basica, anche grazie al supporto di un quarto residuo di istidina (His-64). Lo ione idrossido risultate, coordinato allo ione zinco, esercita un attacco nucleofilo su una molecola di anidride carbonica, convertendola in idrogenocarbonato. E’ grazie a questo meccanismo chimico se le maggior parte dell’anidride carbonica sciolta nel sangue viene trasportata sotto forma di idrogenocarbonato.

Ho riportato solo un paio di esempi per mettere in chiaro quanto lo zinco sia essenziale per la salute dell’uomo. Lo zinco riveste davvero tantissimi ruoli biologici, per esempio influenza sia la divisione sia il differenziamento cellulare, è un regolatore dell’espressione genica e dell’apoptosi, rientra (come abbiamo detto) nella costituzione dei domini a dita di zinco, che si ritrovano in genere nei fattori di trascrizione per il legame al DNA.

Lo zinco ha anche un ruolo nell’ambito della neurotrasmissione glutammatergica. Il ruolo fisiologico del rilascio sinaptico dello ione zinco è comunque ancora oggi poco chiaro. Tuttavia sappiamo che lo zinco blocca la conduttanza dei recettori-canale NMDA e GABA_A, oltre ai canali voltaggio-dipendenti per gli ioni K⁺, Na⁺ e Ca²⁺, mentre esso stesso può dare un flusso ionico tramite i recettori AMPA permeabili al Ca²⁺.

Nel cervello, lo ione zinco ha un ruolo-chiave nei processi di plasticità sinaptica, importanti nell’ambito dell’apprendimento, e partecipa ai fenomeni LTP e LTD. Tuttavia, lo zinco è anche indicato come una neurotossina se presente ad alte concentrazioni nel citosol o nello spazio extracellulare, poiché è in grado di innescare fenomeni di eccitotossicità da glutammato, pertanto devono esistere dei sistemi che garantiscano il mantenimento della concentrazione di zinco entro livelli omeostatici, in modo tale da assicurare il corretto funzionamento delle attività nel Sistema Nervoso Centrale. Alcuni studi, per esempio, hanno evidenziato che esiste una stretta associazione tra l’omeostasi dello zinco con la patogenesi e la progressione di alcune malattie neurologiche come la malattia di Alzheimer.

In condizioni fisiologiche, la concentrazione di zinco nel cervello di un adulto è di circa 200 μM. All’interno del cervello, la concentrazioni citosolica ed extracellulare non superano l’1 μM. Lo zinco è inoltre relativamente concentrato nell’ippocampo e nell’amigdala. Circa il 90% dello zinco presente nel cervello è contenuto in metalloproteine. La restante parte è immagazzinata all’interno di specifiche vescicole sinaptiche dei neuroni glutammatergici – mediante il trasportatore ZnT3 – e viene rilasciata in risposta alle stimolazioni dei terminali presinaptici. I neuroni del circuito ippocampale sono principalmente glutammatergici e contengono vescicole di zinco nei terminali presinaptici. Lo zinco è infatti particolarmente abbondante  nei terminali delle fibre muscoidi del giro dentato e si trova inoltre nei neuroni delle aree CA3 e CA1. Vescicole contenenti zinco si trovano anche nei neuroni GABAergici sia corticali che ippocampali.

Un modo per determinare il flusso di zinco nelle sinapsi chimiche dei neuroni glutamatergici ippocampali è stato utilizzare l’indicatore fluorescente ZnAF-2. Le cellule assumono la forma diacetilata di questa sostanza (ZnAF-2 DA) e la idrolizzano in ZnAF-2, che non è invece capace di attraversare le membrane cellulari. Utilizzando questo indicatore è stato possibile seguire varie cose: il rilascio di zinco dai terminali presinaptici (nel corso di una stimolazione tetanica), il flusso dello ione nei neuroni postsinaptici ed il processo di uptake di zinco nuovamente nei terminali.

In uno studio, pubblicato nel 2002 su Journal of Physiology, i dati riportati indicano chiaramente che il rilascio di zinco blocca i recettori NMDA a livello della sinapsi tra le fibre muscoidi e i neuroni CA3. Inoltre, a seguito dell’attivazione dei terminali presinaptici, lo zinco rilasciato si accumula nei neuroni postsinaptici, attraversando la membrana plasmatica soprattutto per mezzo dei recettori AMPA permeabili al calcio, ma anche attraverso i canali voltaggio-dipendenti per il calcio e addirittura mediante gli scambiatori Na⁺/Ca²⁺. Tuttavia, l’ampiezza delle correnti di Ca²⁺ attraverso i recettori AMPA è maggiore rispetto a quella delle correnti di Zn²⁺, come risulta da analisi condotte utilizzando la tecnica patch-clamp a cellule intere.

Lo ione zinco non blocca l’ingresso di calcio attraverso i recettori AMPA. In questo studio, infatti, si dimostra che l’aggiunta di zinco (0,3 mM) in una soluzione contenente Ca²⁺ 3 mM non blocca l’influsso del calcio, anzi amplifica leggermente la corrente in ingresso. Inoltre, quando le correnti di Zn²⁺ (3 mM) indotte da AMPA sono registrate in presenza di Ca²⁺ 1 mM, l’ampiezza della corrente aumenta notevolmente.

Possiamo ritenere perciò che l’ingresso di zinco nei neuroni postsinaptici mediante i recettori-canale per il glutammato possa avere un certo ruolo causativo nella degenerazione dei neuroni piramidali ippocampali – in particolare CA3 e CA1 – associata ai casi di epilessia e di ischemia. In condizioni normali, però, l’influsso di zinco può avere un significato fisiologico importante nei processi LTP e nella plasticità sinaptica. Inoltre, pare che la ricaptazione dello zinco extrasinaptico da parte dei neuroni presinaptici serva da modulazione negativa nei confronti del rilascio vescicolare di glutammato. In questo senso, lo ione Zn²⁺ avrebbe attività di neuroprotezione poiché, agendo a feedback negativo, è capace di evitare l’instaurarsi di possibili fenomeni di eccitotossicità.

In un altro studio, pubblicato su Journal of Neurochemistry nel 2004, grazie ad esperimenti condotti su sinaptosomi ottenuti da fibre muscoidi ippocampali di ratto (tramite omogeneizzazione e frazionamento per centrifugazione del tessuto nervoso), si è visto che lo zinco sarebbe in grado di inibire il rilascio vescicolare di glutammato attraverso l’attivazione dei canali per il potassio rettificanti verso l’interno (cioè che conducono più corrente verso l’interno che in direzione opposta) ATP-dipendenti (K_ATP). In presenza di 4-AP, un inibitore non selettivo dei canali per il potassio voltaggio-dipendenti, lo zinco (5 o 10 mM) riduce del 66% il rilascio di glutammato dalle fibre muscoidi rispetto al 4-AP da solo. Il Tolbutamide, bloccante dei canali per il potassio, è una sulfanilurea che invece amplifica il rilascio indotto da 4-AP. Il fatto che il Tolbutamide aumenti e lo zinco riduca  il rilascio di glutammato indotto da 4-AP fa ritenere che i canali canali K_ATP operino anche in condizioni depolarizzanti, quando inoltre possono essere stimolati dallo zinco rilasciato dai terminali presinaptici delle fibre muscoidi durante la neurotrasmissione. In questo senso, lo zinco può agire a feedback negativo sulla trasmissione glutammatergica e impedire l’esposizione dei neuroni postsinaptici ad un ipertono di glutammato che può avere effetti di tipo eccitotossico.

Le fibre muscoidi dell’ippocampo presentano appunto molti canali K_ATP (chiamati anche “KIR”, per via del fatto che sono costituiti da quattro subunità omonime, oltre a quattro subunità SUR, ossia recettori della sulfanilurea) sui loro terminali presinaptici. Le correnti che attraversano questi canali sono inibite dall’ATP intracellulare e di fatto la loro attività dipende dallo stato metabolico della cellula. Uno stato di bassa disponibilità energetica  e di iperpolarizzazione determina l’attivazione di questi canali, cui segue il potenziale di riposo. La loro attivazione si ha per esempio durante le risposte ischemiche, per effetto della caduta del metabolismo energetico e ha un significato di neuroprotezione. Questi canali rappresentano quindi un punto di integrazione tra metabolismo e potenziale di membrana.

Il ruolo neuroprotettivo dello zinco è stato analizzato mediante l’allestimento di colture di neuroni ippocampali (fette di ippocampo) trattate in condizioni di anossia e ipoglicemia, tali da indurre danni alle cellule, e quindi attraverso la misura dell’emissione fluorescente da parte del propidio di ioduro (PI). La luce fluorescente è stata perciò misurata, considerando che l’intensità è direttamente proporzionale al danno cellulare. L’applicazione di zinco (1 μM) durante l’evento ischemico riduce notevolmente il livello di morte cellulare rispetto al controllo. Inoltre, la chelazione dello zinco, mediante Ca-EDTA (500 μM), annulla il suo effetto neuroprotettivo, mentre l’aggiunta di Tolbutamide (250 μM) ne antagonizza gli effetti.

A livello postsinaptico, durante la trasmissione glutammatergica, lo zinco può esercitare diverse funzioni sia fisiologiche che patologiche, come abbiamo avuto modo di scoprire. Per esempio, partecipa ai processi di potenziamento a lungo termine della risposta sinaptica (LTP), probabilmente andando ad agire sui recettori metabotropici per il glutammato mGlu5, ma può anche avere effetti neurotossici analoghi a quelli indotti da un eccesso di Ca²⁺ (eccitotossicità).  Elevate concentrazioni di zinco (10-100 μM) intracellulare infatti aggravano i danni ischemici anziché prevenirli. Ciononostante, sembra improbabile che tali livelli di zinco possano essere raggiunti tramite rilascio sinaptico.

Per la stesura di questa parte ho citato alcuni articoli che trovate elencati sotto. Chiudo qui il discorso sul ruolo dello zinco nella neurotrasmissione glutammatergica e vi invito a seguire la prossima parte, dove scriverò sull’eccitotossicità nella patogenesi della Sclerosi Laterale Amiotrofica. A presto!